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血小板减少在临床上很常见。病理性的血小板减少常见于脾功能亢进、再生障碍性贫血、原发性血小板减少性紫癜、继发性血小板减少性紫癜、白血病等［1, 2］。还有一些其他原因造成的血小板假性减少，如血小板聚集、大血小板、血小板卫星现象等［3, 4］。血小板聚集引起的血小板假性减少在临床上经常发生，严重的血小板聚集会造成血小板计数的重度减少，造成临床诊疗的错误判断，给患者及家庭带来经济及精神负担［5］。因此，在血细胞分析中，保证血小板计数结果的准确性，防止假性结果发生特别是血小板聚集引起的假性减少是血细胞分析复检的重要方面。筛选出假性的血小板减少并采取进一步的纠正措施是血细胞分析复检工作的重要环节。
按照传统的复检流程，对于血小板减少的标本，排除标本凝集原因外，必须推片染色后在显微镜下观察排除血小板聚集、大血小板、血小板卫星现象等引起血小板假性减少，并在显微镜下估算血小板数量，确认仪器计数的准确性。其流程繁琐，效率低下。近十年来，数字细胞形态分析技术已经在血细胞形态分析中广泛应用，其以自动、高效的检测优势在血细胞形态特别是白细胞和红细胞形态分析中发挥了重要作用［6, 7, 8, 9, 10, 11, 12］，相关的研究也比较多，但对其血小板聚集检测功能的评价较少。
本研究拟选取西京医院2019年1月1日至6月30日所有血细胞分析结果中触及血小板减少复检规则的标本，推片进行瑞吉染色，分别用人工显微镜和数字细胞分析系统观察血小板聚集情况，以显微镜法作为参考方法，评价数字细胞分析技术对血小板聚集的监测能力。
对象与方法
一、对象
采取整体抽样方法，选取西京医院2019年1月1日至6月30日所有临床科室（包括内科、外科、妇科、儿科、皮肤科、中医科等43个科室）住院患者的血细胞分析结果中触及血小板减少复检规则的标本4 271份。排除因为标本凝集不合格造成的血小板减少样本。其中，男性患者标本2 200份，女性患者标本2 071份，年龄（35.0±7.03）岁。纳入样本的临床疾病诊断涵盖了临床各个科室的疾病类型。本实验室血小板减少的复检规则为血细胞分析结果中血小板<80×109/L或 80×109/L<血小板<125×109/L并有血小板聚集报警。本研究经西京医院伦理委员会批准（20193375-1），并豁免研究对象签署知情同意书。
二、方法
1. 主要试剂与仪器：CellaVision DM96全自动数字血细胞分析系统（瑞典CellaVision 公司），XE-2100血细胞分析仪及配套试剂和配套质控品（日本sysmex公司），全自动推片染片机SP-100（日本Sysmex公司），瑞吉染色液（珠海贝索生物技术有限公司）。
2. 血细胞分析：标本检测前做室内质控，质控在控后，严格按照血细胞分析作业指导书检测标本，记录血小板数值。对血小板减少的标本首先检查标本性状，发现血液凝固的标本按不合格标本处理。其次，对标本合格的触及血小板减少复检规则的标本经自动推片机推片、染色。
3.观察血小板聚集：自动推染片机制好的触及血小板减少复检规则的血涂片在数字血细胞分析系统中进行分析，观察所有的图像界面，包括白细胞分类界面、非白细胞界面、红细胞分析界面、血小板分析界面，不局限于只观察非白细胞界面的血小板聚集检测的图像。记录有无血小板聚集及聚集严重程度。
4.显微镜观察血小板聚集：人工显微镜观察血小板聚集是血小板聚集检测的参考方法。数字细胞分析系统阅片后，采用双盲的方法，由2位经验丰富的形态学工作人员在显微镜下观察血小板聚集情况。方法是从体尾交界处开始仔细观察血涂片，重点观察血涂片的两侧边缘和尾部，记录有无血小板聚集及聚集程度。
5.血小板聚集判断标准：依据聚集对血小板计数的影响程度，把10个以上血小板的聚集界定为血小板聚集，把5~10个血小板的聚集分布界定为血小板弱聚集，4个以下的血小板聚集忽略为无聚集。为了避免弱聚对低值血小板的影响，对于血小板<80×109/L的低值标本，把5堆以下的少量弱聚集和5堆以上的3~4个的血小板聚集也界定为聚集。
6.血小板聚集纠正方法：确认血小板聚集的标本，通知临床用乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）和枸橼酸钠抗凝的采血管重新采集两份标本同时进行检测，若两份标本结果一致，推片证实无聚集存在，和初次血细胞分析结果比较明显增加，确认血小板聚集纠正，考虑是采血原因造成的血小板聚集。若EDTA-K2抗凝管血小板检测结果和初次没明显变化，枸橼酸钠抗凝标本血小板结果明显增加，推片证实枸橼酸钠抗凝标本无聚集存在，EDTA-K2抗凝管标本聚集仍存在，考虑EDTA依赖性血小板聚集。若果EDTA-K2和枸橼酸钠抗凝标本结果和初次检测结果一致，推片证实聚集都存在，说明未纠正，可以更换肝素锂抗凝剂重新采血检测或者用不加抗凝剂的干燥管采血后立即上机检测。
三、统计学分析
采用SPSS 19.0软件MEDCALC软件进行统计分析。计数资料以例（%）表示，组间率的比较采用卡方检验。双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、触及血小板减少复检规则的血细胞分析标本占比、分布情况及血小板聚集的检出及纠正结果
89 183份住院标本中触及血小板减少规则的标本4 271份，检出血小板聚集133份，在触及血小板<80×109/L的规则标本中检出112份，占血小板聚集标本的84.2%，在触及80×109/L<血小板<125×109/L并有血小板聚集报警的规则标本中检出21份，占血小板聚集标本的15.8%。经过EDTA-K2抗凝管重新采样血小板计数纠正的标本121份，纠正率90.97%，更换枸橼酸抗凝剂纠正9份，重新采样和更换枸橼酸钠抗凝剂不能纠正的3份，更换肝素锂抗凝剂纠正的1份，枸橼酸钠和肝素锂均不能纠正的2份。
二、数字血细胞分析系统（简称仪器法）和显微镜法检出血小板聚集结果比较
133份血小板聚集标本中，仪器法共检出129份，人工显微镜初次检出128份。仪器法与人工显微镜（初次）法对血小板聚集标本检出的敏感度差异无统计学意义（χ2 =0.115，P=0.73）；仪器法对血小板聚集检出的敏感度低于显微镜法（初次+再次确认），差异有统计学意义（χ2 =4.061，P=0.04）。在仪器法检测中，同时观察红细胞分析界面+血小板聚集界面+白细胞分析界面对血小板聚集检出的敏感度高于只观察血小板聚集界面，差异有统计学意义（χ2=5.090，P=0.02），见表1。
表一：仪器法不同分析界面对血小板聚集的检出结果
仪器法检出而显微镜法初次未检出的标本在显微镜下花更长时间最终证实这5份标本均有血小板聚集。显微镜法漏检的5份血小板聚集多表现为弱聚、聚集堆数较少或只在血涂片体尾交界处分布。显微镜法检出而仪器法漏检的4份标本的血小板聚集主要分布在血涂片的尾部及边缘，且聚集量较少，见表2。仪器法和显微镜法漏检的血小板聚集标本纠正前后血小板结果偏差的平均误差，仪器法明显高于显微镜法，差异有统计学意义（χ2 =56.26，P<0.01），见表3。
表二：仪器法和显微镜首次检测血小板聚集标本结果不一致原因
表三：仪器法和显微镜法未检出血小板纠正前后结果比较
讨论
血小板具有黏附、聚集、释放、收缩性和吸附的生理特性，能够维持血管内皮细胞的完整性，参与凝血、止血过程。血小板的数量减少或质量异常时，会引起出血。在血细胞分析中，很多因素会引起血小板计数假性减少，最常见的因素是血小板聚集，包括采血不畅、EDTA抗凝剂诱导、冷凝集素等原因均可引起血小板聚集［13］。采血不畅引起的血小板聚集最常见，通过重新采样可以纠正。关于EDTA-K2抗凝剂诱导血小板聚集的机制目前尚不清楚。有些专家认为血小板的聚集始于各种诱导剂与血小板膜受体之间的相互作用，这种相互作用通过膜的传递而激活血小板，使其膜表面另一个受体糖蛋白Ⅱb/IIIa活化，再与血浆中的纤维蛋白原结合，介导血小板聚集［14］。有文献报道其发生率为0.07%~0.11%［15］。本实验中发现了133份血小板聚集标本，通过重新采样纠正的为121份，占90.97%，也证实了标本采集原因是引起血小板聚集，造成血小板假性减少的主要因素之一。这一结果与郭春霞等［16］的研究结果一致。本研究中EDTA-K2抗凝有血小板聚集的标本，重新采样不能纠正，更换枸橼酸钠抗凝剂可以纠正的标本12份，推测为EDTA-K2依赖的血小板聚集，其发生率为0.013%，与张璐璐等［17］研究结果相似，低于文献报道 0.07%~0.11% 的发生率，可能与取样人群有关。只有2份标本对3种抗凝剂同时依赖引起血小板聚集，占血小板聚集标本的1.5%，占血小板减少复检标本的0.046%。
血细胞复检是血细胞分析中质量控制的核心环节，制定合适的复检规则尤为重要。血小板相关的复检规则主要包括血小板计数类、直方图异常类、异常报警类等。本实验室在制定规则时尽可能地拦截可能引起血小板假性结果特别是假性减少的结果。本实验室最初的血小板减少复检规则是血小板<80×109/L，但在我们的日常工作中发现血小板在80×109/L~125×109/L之间也有血小板聚集，造成血小板计数低于参考值125×109/L。为此，我们增加了80×109/L<血小板<125×109/L合并血小板聚集报警的规则。从本实验结果看，在触及 80×109/L<血小板<125×109/L并有血小板聚集报警规则的标本中检出21份血小板聚集，占血小板聚集标本的15.8%，也证明增加这条复检规则的必要性。
血细胞复检的主要目的是识别仪器不能识别、识别有误的异常、正常细胞，发现仪器计数的假性结果并及时纠正。在血小板复检中，一线人员关注更多的是仪器检测出现的血小板假性结果，特别是假性减少的结果。因为血小板假性减少不仅给患者诊疗带来偏差，而且引起的医疗纠纷屡见不鲜。目前，无论是进口还是国产的血细胞分析仪，都具有血小板聚集的报警功能，虽然报警的敏感性都很高，但在实际工作仍发现有血小板聚集报警的假阴性。为了避免血小板聚集出现血小板假性减少结果，大多数实验室对低值血小板制定复检规则需要推片复检排除血小板聚集引起的假性减少［18］。本实验室制定血小板减少推片复检规则是血小板<80×109/L或80×109/L<血小板<125×109/L并有血小板聚集报警。从2019年1月至5月89 183份血细胞分析标本中触及这个规则的标本为4 271份，占血细胞分析总数的4.79%，占所有复检标本约1/4。说明血小板减少复检的工作量还是比较大的，传统的显微镜法无法满足复检要求，也存在费时、个体差异，难于标准化的缺点。近20年来，数字细胞分析技术在血细胞形态分析特别是在白细胞和红细胞形态分析中得到广泛应用，其最大的优势是自动化和高效，但对其血小板的分析能力特别是对血小板聚集的检测能力评价较少。本研究通过仪器法和显微镜对触及血小板减少复检规则的4 271份标本观察血小板聚集情况，共检出血小板聚集133例，仪器法检测敏感度为96.99%，显微镜法初次检测敏感度为96.24%，两者方法对血小板的检测敏感度差异无统计学意义。该结果高于Gulati 的研究结果［19］，可能与本实验使用仪器法观察血小板聚集的方法有关。仪器法漏检的4例和显微镜漏检的5例血小板聚集标本纠正前后血小板结果偏差的平均误差分别是56.43%和25.38%，两者具有显著性差异。结合仪器法和显微镜法漏检的9例血小板聚集的原因可以看出，仪器法更易漏检真正的容易引起结果很大偏差的血小板聚集。虽然本实验显微镜法初次漏检的血小板聚集通过延长时间可以检出，但不太符合实际工作情况。因此，无论使用仪器法还是人工显微镜的方法都需要尽可能做到浏览血片的体尾交界处、两侧边缘和尾部四个部分全覆盖才能做到不漏检。虽然人工显微镜法可以做到四部分全覆盖，但是在复检标本量比较大时，为了保证检测周转时间，难以做到效率和质量兼顾，也会漏检血小板聚集。虽然本研究仪器对异常细胞及血小板聚集具有较高的检出率，但其不具备扫描血涂片边缘和尾部的功能，对于血小板聚集只分布在边缘和尾部的标本容易出现漏检，只观察血小板聚集界面不观察其他界面图像也会造成漏检。从实验结果可以看出只在血小板聚集检测界面检测血小板聚集的敏感度为90.22%，在所有界面检测的敏感度提高到96.99%，差异有统计学意义。因此，用仪器法观察血小板聚集时，需要仔细观察所有界面图像，确认血小板是否存在聚集；对于血小板严重降低、LIS结果差异比较大、与诊断治疗不相符或首次结果，如果本仪器所有图像界面未发现血小板聚集，鉴于本研究仪器不具备扫描血涂片边缘和尾部的功能，需要通过人工显微镜再确认，重点关注边缘和尾部。
目前市场上已经存在能够扫描血涂片边缘和尾部或全片扫描的数字细胞分析仪在临床使用，未来，瑄立针对外周血研发的数字细胞分析仪产品将能够实现扫描血涂片边缘、尾部及全片的功能，彻底解决血小板聚集检测漏检的问题，实现血小板聚集检测的自动化，解放人力，提高效率，提高血细胞分析特别是血小板检测的质量。
引用略。
苏公网安备：32021102001500号